2024 年 9 月 11 日，国家干细胞转化资源库再生医学研究所何志颖教授、张文成副研究员团队与美国北卡罗来纳大学教堂山分校（UNC-CH）Lola Reid教授团队在 Bioactive Materials 上发表题为“Hormonally and Chemically Defined Expansion Conditions for Organoids of Biliary Tree Stem Cells”的研究论文。该研究建立了一个完整定义的 BTSC 类器官扩增体系，该体系通过分析确定 BTSC 类器官体外扩增微环境的必须组分，建立了名为 BTSC水凝胶扩增体系（Biliary tree stem cell expansion hydrogel system, BEX），成功地实现了对 BTSCs 及其类器官成千倍的扩增。扩增后的 BTSCs 及其类器官不但在体外可分化为功能性肝细胞。在体内，通过项目组前期建立的干细胞补片移植，可有效救治肝衰竭小鼠。该体系的建立，为 BTSCs 的临床应用制备充足数量和完整功能的种子细胞提供理想体系。

人胆管树干细胞（biliary tree stem cells, BTSCs）是位于肝内、肝外和胰外胆管树壁内胆管周腺（peribiliary tree glands, PBG）内的干细胞龛中的肝/胰腺共祖干细胞。在器官发育和再生过程中，BTSCs 可产生多种干细胞亚群，一方面通过向位于赫林管内或附近肝干细胞（hepatic stem cells, HpSCs）及其后代肝母细胞（hepatoblast, HBs）分化介导肝再生。另一方面，通过分化为位于肝/胰腺总导管的 PBG 的胰腺干细胞介导胰腺再生。

早期印度开展的一项临床试验表明，移植从胎儿肝脏中分离出的HpSCs和HBs 的混合物可以挽救 80%以上的终末期肝病患者，这与接受标准疗法并在半年至一年内死亡的患者相比，可提供至少两年的生存期。而另一项意大利的临床试验发现，移植胎儿来源的 BTSCs 同样可以有效救治患者。且由于其低免疫原性，受试者移植后在无免疫抑制剂使用的情况下，在随访的一年内，未发现免疫排斥反应。因此，证实 BTSCs 在肝脏和胰腺功能损伤修复中具有重大应用前景。然而，实现 BTSCs 的临床应用尚需解决三个关键问题：其一，BTSCs 获取和扩增；其二，BTSCs 移植定植效率；其三、BTSCs 移植后功能成熟和命运转归。

为了明确 BTSCs 的候选有丝分裂原，本研究通过比较 BTSC 与成熟肝实质细胞的转录组图谱，确定 BTSCs 干性维持的关键信号通路（如 Hippo、PI3K/AKT、MAPK 和 Ras 信号通路）。通过结合研究团队前期对胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES）和胃上皮细胞来源的内胚层干细胞的研究，确定了包括0.5μM Bix01294、2μM Bay K8644、0.04μM RG108、2μM SB431542、10μM 毛喉素和 1μM A83-01等小分子化合物，与 50 ng/mL EGF、100 ng/mL R-Spondin1（RSPO1）、100 ng/mL Noggin和50 ng/mL Wnt3a等生长因子或旁分泌信号组合构成 10 因子-确定增殖培养基（10-Defined-Proliferative-Medium, 10-DPM），成功地实现了原代 BTSCs的扩增（7 天，20 倍扩增）。后续研究发现，该 10-DPM 不但可以有效维持 BTSCs 的传代扩增，而且在结合水凝胶（Matrigel 或者透明质酸-肝素水凝胶）的三维扩增体系下，可以获得 BTSC 类器官，并实现 BTSC 类器官的长期扩增传代。

对于 10-DPM 展开组合优化筛选结果证实，在所有的小分子化合物中， DNA 甲基化酶抑制剂 RG108、TGFβ信号通路抑制剂 A83-01、cAMP 激动剂毛喉素、钙离子通道激动剂 Bay K8644 组成的 4-DPM 是原代 BTSCs 扩增的必须组分。然而，在缺乏 Wnt 信号通路的激活配体 RSPO1 的情况下，BTSCs 的传代和类器官的形成和持续传代能力受到了明显影响。而添加RSPO1 组成的 5-DPM 可以发挥与 10-DPM 相当的促进原代 BTSCs 增殖、BTSCs 二维扩增和 BTSC 类器官形成和长期扩增维持的能力，因此证实了Wnt 信号通路在 BTSCs 扩增和 BTSC 类器官形成中扮演的关键角色。

比较二维条件，基于水凝胶的三维扩增体系展现出了明显的优势。在5-DPM 作为扩增培养基的情况下，水凝胶预处理的二维体系仅能在有限代次内维持 BTSCs 属性。相比之下，BTSC 类器官可在 5-DPM 条件下，稳定传代 20 代以上，实现在 60 天内完成 3000 倍以上的细胞扩增。通过对二维和三维条件下扩增的 BTSCs 的转录组图谱进行比较分析，结果发现，三维扩增体系可以最大限度地减少细胞增殖过程中产生的 DNA 损伤，从而为细胞提供二维单层培养中所缺乏的损伤保护。

在确认了培养基后，该研究进一步对水凝胶的成分进行了优化。与其他三维培养扩增研究相似，本研究中首先借鉴了 Hans Clevers 等团队基于Matrigel 的类器官形成和维持体系。Matrigel（康宁）主要由四种主要的基底膜成分组成，包括层粘连蛋白（约 60%）、IV 型胶原（约 30%）、巢蛋白（约 8%）和硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPGs）尤其串珠蛋白（约 2-3%）。其他组分的生物学活性已经有大量研究，但其独立于蛋白多糖的 GAG 尚未确定。通过结合 BTSCs 体内微环境中的糖胺聚糖组分，通过在透明质酸水凝胶中添加硫酸乙酰肝素及其蛋白多糖组分（HAHS），成功地实现对Matrigel 的替代。并最终与 5-DPM 结合，形成成分确定的 BTSCs 类器官体外扩增的 BEX 体系。

本研究建立了 BEX 体系，实现了 BTSCs 及其类器官的体外大量扩增，扩增后的BTSCs具有肝向分化和救治肝衰竭模型的能力，为推动基BTSCs 移植救治肝衰竭的临床转化应用提供稳定种子细胞制备体系。